Western blotting ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒

Western blotting ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，加入發(fā)光底物后，能讓膠片感光。經(jīng)顯影和定影后，可以在膠片上顯示出條帶（抗原所在位置）。

操作步驟：(僅供參考)

常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后:

1) 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標(biāo)記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T 漂洗3 次每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。

2) 按5g 封閉試劑加100ml 雙蒸水計(jì)，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過(guò)的轉(zhuǎn)印膜放入封閉液內(nèi)，置搖床孵育，室溫封閉30min。用TBS-T 緩沖液（PH7.6）洗膜，室溫漂洗3 次每次5min。

3) 將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml 10×抗體稀釋液加入90ml 雙蒸水，混勻，可4℃保存三個(gè)月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。

4) 用1×的抗體稀釋液稀釋一抗。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來(lái)稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過(guò)夜或37℃搖動(dòng)孵育2h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標(biāo)記，分開(kāi)孵育。

5) 用TBS-T 緩沖液（PH7.6）洗膜，室溫漂洗3 次每次5min。

6) 用1×的抗體稀釋液稀釋二抗。根據(jù)用量，按10ml 抗體稀釋液加入15ul HRP 標(biāo)記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃搖動(dòng)孵育1h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。

7) 用TBS-T 緩沖液（PH7.6）洗膜，室溫漂洗3 次每次10min。

8) 根據(jù)用量，取ECL 發(fā)光液A、B 等量混勻，加在膜正面，暗室顯色1-5 分種。傾去顯色液，小心用紙吸去顯色液，在上面蓋一層平整的透明紙。再取出感光膠片，做好標(biāo)記，輕輕的放在膜上，顯色30 秒到1 分鐘，取出膠片浸入顯影液中，觀察顯色情況，再放入定影液中1 分鐘。根據(jù)條帶強(qiáng)弱，再次感光時(shí)可減短或者加長(zhǎng)感光時(shí)間（從5 秒到30 分鐘）以期達(dá)到理想結(jié)果。

注意事項(xiàng)：

1. 請(qǐng)根據(jù)一抗來(lái)源選擇試劑盒。

2. 可以根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。如背景過(guò)深，可延長(zhǎng)膜封閉時(shí)間，加長(zhǎng)最終漂洗次數(shù)與時(shí)間。如果條帶過(guò)弱，可增加抗體濃度，可延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間或加長(zhǎng)感光時(shí)間。

3. TBS-T（0.01M，PH7.6）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml 的雙蒸水溶解，用鹽酸調(diào)PH 到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習(xí)慣來(lái)配制）