干擾物質(zhì)的用途，怎么使用

 干擾物是IVD診斷試劑檢測誤差的一個很重要的來源，它們在某種程度上對病人來說表現(xiàn)為是一種危害。常規(guī)工作中精密度通過室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)控，準確性通過與參考物質(zhì)作比較試驗進行驗證，但實驗室不能很容易的檢測干擾物質(zhì)引起的誤差。分析特異性是指被測物檢測結(jié)果不受其它成分干擾的能力，也就是說，診斷試劑的檢測結(jié)果會因為一些物質(zhì)的存在而受到影響，導(dǎo)致和實際情況有偏差。常見的干擾因素包括了溶血、血脂、膽紅素和生物素等。檢測方法已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于體外診斷試劑，但是任何免疫檢測方法都有可能受到干擾出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果，其中內(nèi)源性干擾往往是由于試劑中使用的抗體與病人樣本中的內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)所致，這類干擾統(tǒng)稱為內(nèi)源性干擾。最易受到干擾的為基于雙抗體夾心法、競爭抑制法的免疫比濁、側(cè)向?qū)游?、化學(xué)發(fā)光及，酶聯(lián)免疫方法等，此外，IgM檢測試劑亦會受到這類物質(zhì)的干擾。內(nèi)源性干擾物質(zhì)主要分為以下幾類：

A類風(fēng)濕因子 （Rheumatoidfactors，RF）

一、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factor，RF)是一種抗人或動物IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體。RF最初由Rose等(1984年)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清中發(fā)現(xiàn)。RA患者體內(nèi)有產(chǎn)生RF的B細胞克隆，在變性IgG或EB病毒的直接作用下可大量合成RF,RF主要為IgM類自身抗體，但也有IgG類、IgA類、IgD類和IgE類。

二、干擾引起假陽性的原因：

雙抗體夾心法檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體和信號抗體一般均為 IgG，當樣本中的 RF 能同時與這兩種抗體Fc 段結(jié)合時，便會將捕獲抗體與信號抗體橋接，形成捕獲抗體-RF-信號抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生非特異性的檢測信號，造成檢測結(jié)果的假性增高或假陽性，引起這種干擾的可能是 IgM-RF、IgG-RF 或者其他型別。人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標記二抗的Fc段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。

RF對捕獲法干擾有兩種可能的機制，一種是由 IgM-RF 引起，由于第一步 IgM 的捕獲是非特異性的，IgM-RF 同樣被捕獲，被捕獲的 IgM-RF 最后與信號抗體( IgG 或 IgG 的抗原抗體復(fù)合物) 結(jié)合，產(chǎn)生檢測信號; 另一種機制則與雙抗體夾心法類似，由 RF 直接將捕獲抗體和信號抗體橋接，同樣會引起假性增高或假陽性。

三、輸入類風(fēng)濕因子干擾的排除

1.用F（ab)替代完整的IgG。

2.標本用聯(lián)有熱變性（63°C，10min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）。

3.檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標本稀釋液中，使RF降解。

B.異嗜性抗體(HA)

一、異嗜性抗體可以與許多動物免疫球蛋白的fc和fab等部位上的表位結(jié)合，模擬被測抗原的免疫活性，同時結(jié)合捕獲抗體、標記抗體干擾實驗。異嗜性抗體對免疫球蛋白具有多特異性，但其親和力較弱。其免疫干擾的程度與頻率與自身的濃度、親和力及檢測系統(tǒng)等有關(guān)。

二、干擾引起假陽性的原因：

夾心法免疫檢測至少使用兩種針對不同表位抗原的抗體，捕獲抗體在固相，標記抗體游離在溶液中。正常情況下，樣本中的抗原與兩抗體結(jié)合，標記抗體與固相結(jié)合的數(shù)量與樣本中的抗原濃度成正比（圖1）。異嗜性抗體在無抗原的情況下，也可以橋連這兩種抗體，因而增加結(jié)合標記抗體的濃度（圖2），造成假陽性結(jié)果。

最常見的抗體異嗜性抗體是HAMA（Human anti-mouse Antibodies），對臨床免疫實驗結(jié)果產(chǎn)生重大影響，HAMA 的免疫干擾主要表現(xiàn)在“兩步夾心法"為原理的免疫分析中可引起HAMA 橋聯(lián)介導(dǎo)的假陽性或HAMA封閉抗體導(dǎo)致的假陰性的結(jié)果 。

三、干擾排除的方法

1.使用特異的抗體F(ab’)2片段作為固相或測定酶標抗體。

2.在標本或標本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。

3.使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應(yīng)。因而，用其作為固相或酶標抗體不會出現(xiàn)假增高或假降低結(jié)果。

C生物素（biotin）

一、生物素又被稱為維生素 B7或維生素H，是一種水溶性B族維生素。生物素的缺乏主要會損害皮膚、粘膜和神經(jīng)系統(tǒng)，在普通人群中長期的生物素缺乏可能導(dǎo)致毛發(fā)、指甲、皮膚的損害。生物素-親合素系統(tǒng)是上世紀70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)?，F(xiàn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。生物素可與幾乎所有生物大分子結(jié)合，親和力高，結(jié)合穩(wěn)定，靈敏度高，具有多級放大作用。生物素干擾存在于使用生物素-親和素系統(tǒng)或生物素-抗生物素系統(tǒng)的檢測中。

二、干擾引起假陽性的原因：

外源性生物素對基于 BAS 化學(xué)發(fā)光的干擾機制基于 BAS 的化學(xué)發(fā)光通過可被測量的光信號對待測物質(zhì)進行測定?？杀粶y量的光信號由生物素標記物 - 待測物質(zhì) - 發(fā)光物質(zhì)標記物 - 鏈霉親和素磁微粒復(fù)合物產(chǎn)生，該復(fù)合物的多少與光信號成正比。外源性生物素對基于 BAS 的化學(xué)發(fā)光干擾的機制是由于外源性生物素和試劑來源的生物素會競爭性的與鏈霉親和素磁微粒 (streptavidin-coated microparticles,M) 結(jié)合 ，當外源性生物素達到一定量時，反應(yīng)體系中的生物素總量超過了鏈霉親和素磁微粒的結(jié)合能力，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)被捕獲減少，光信號減弱，從而引起干擾。

三、干擾排除的方法

1.增加鏈霉親和素含量或者鏈霉親和素預(yù)處理樣本。

2.使用D-生物素抗體替代鏈霉素親和素或使用生物素阻斷劑。

D血紅蛋白

溶血（Hemolysis） 紅細胞破裂，血紅蛋白逸出稱紅細胞溶解，簡稱溶血?？捎啥喾N理化因素和毒素引起。在體外，如低滲溶液、機械性強力振蕩、突然低溫冷凍（-20℃～－25℃）或突然化凍、過酸或過堿，以及酒精、乙醚、皂堿、膽堿鹽等均可引起溶血。

標本溶血時可釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測定結(jié)果。

解決方法

標本采集和處理時必須注意避免溶血。

E脂血

脂血是最常見的干擾之一，高脂血標本之所以對檢驗產(chǎn)生干擾，主要是因為脂血中的乳糜顆粒會引起脂濁現(xiàn)象的產(chǎn)生，而脂濁是一種懸浮顆粒，易導(dǎo)致光線的散射，使標本看起來十分渾濁。會對生化檢測的結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。

解決辦法

1.采用高速離心的方法，取其下層清液進行測定。

2.取樣本上層清液放置在冰箱中進行保存，冰箱靜置一天后取出進行測定

3.對樣品用生理鹽水稀釋，當測定結(jié)果出來后再乘以稀釋倍數(shù)。

F膽紅素

膽紅素是膽色素的一種，是人膽汁中的主要色素，呈橙黃色。它是體內(nèi)鐵卟啉化合物的主要代謝產(chǎn)物，有毒性，可對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)引起不可逆的損害，但也有抗氧化劑功能，可以抑制亞油酸和磷脂的氧化。膽紅素、烯醇化的膽紅素和膽綠素三者的光吸收幾乎覆蓋300-900nm之間的波長范圍，在上述波長內(nèi)膽紅素的存在會引起本底吸光度升高，造成本底干擾會對其他一些項目的檢測造成影響。