PCR反應出現(xiàn)假陽性是什么原因造成的，你知道嗎

PCR反應出現(xiàn)假陽性是什么原因造成的，你知道嗎

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術。1976年，中國科學家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發(fā)展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶適合反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

引物設計的基本原則

1.引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
2.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。
3.引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。
4.引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能*互補序列，否則易導致非特異性擴增。
5.引物3‘端的堿基，特別是罪末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，選擇是G和C。
6.引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、第高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

當PCR反應出現(xiàn)假陽性是什么原因，如下：

1) 引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。

2) 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

PCR反應出現(xiàn)假陽性是什么原因造成的，你知道嗎