酵母基因組DNA提取試劑盒使用注意事項(xiàng)

酵母基因組DNA提取試劑盒使用注意事項(xiàng)

本試劑盒采用可以特異性結(jié)合 DNA 的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，提取酵母基因組 DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司*新型材料，能夠高效專一吸附 DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的基因組 DNA 片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒提取的基因組 DNA 可用于各種常規(guī)操作，包括酶切、 PCR、文庫構(gòu)建、Southern 雜交等實(shí)驗(yàn)。 

操作步驟：使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1、取酵母細(xì)胞(不超過 5×107 ce l1 s)，12000rpm 離心 1min，盡量吸除上清。
2、酵母細(xì)胞壁的破除：向酵母菌體中加入 470ul  Buffer。充分懸浮菌體，加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul 巰基還原劑，充分混勻。30℃處理 1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。
3、12000rpm 離心 lmin，棄上清，收集沉淀。
4、向沉淀中加入 200ul 溶液 A，充分懸浮沉淀，向懸浮液中加入 20ul 的 RNase A(10mg/ml)，充分顛倒混勻，室溫放置 10min。
5、加入 20ul 的蛋白酶 K(10mg/ml)，充分顛倒混勻。65℃水浴消化 15-30min，消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直至樣品消化*為止。
6、加入 200ul 溶液 B，再加入 200ul 無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響 DNA 的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，室溫放置 2min

注意事項(xiàng)：
1、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的 DNA 片段較小且提取量下降。
2、若試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在 65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。
3、如果實(shí)驗(yàn)中的離心步驟出現(xiàn)柱子堵塞的情況，可適當(dāng)延長離心時(shí)間。
4、洗脫緩沖液的體積最好不少于 50ul，體積過小會(huì)影響回收效率；洗脫液的 pH 值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)至此范圍)， pH 值低于 7. 0 會(huì)降低洗脫效率。 DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。
5、DNA 濃度及純度檢測：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。DNA 應(yīng)在 OD260 處有顯著吸收峰， OD260 值為 1.0 相當(dāng)于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、40μg/ml 單鏈 DNA。OD260/0D280 比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)?pH 值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。

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