手把手教您使用乳酸脫氫酶（LDH）測試盒

手把手教您使用乳酸脫氫酶（LDH）測試盒

測定意義： LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應，伴隨著 NAD+ /NADH 之間互變。測定原理： LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。需自備的儀器和用品：可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣品測定的準備： 1、細菌、細胞或組織樣品的制備：細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。 

使用 96 孔板測定的計算公式如下： 1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.4554x+0.0037 (x 為標準品濃度，umol/mL；y 為 ΔA)。 2、血清（漿）LDH 活力的計算單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.4554÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037） 3、細胞、細菌和組織中 LDH 活力的計算（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 LDH（nmol/min/mg prot）=（[ ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037） ÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。（2） 按樣本鮮重計算：單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 LDH （ nmol/min/g 鮮 重 ） =[ （ ΔA-0.0037 ） ÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4× （ΔA-0.0037）÷W （3）按細菌或細胞密度計算：單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 LDH（nmol/min/104 cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073× （ΔA-0.0037）V1：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min； Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細胞或細菌總數(shù)，2000 萬；103：1umol/mL=103 nmol/mL。 

1、 標準曲線線性范圍為：0.1 umol/mL -2 umol/mL。 

2、 ΔA 線性范圍為：0.01 -1。