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植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA 比色法)的計算

更新時間:2023-12-20      瀏覽次數(shù):286

 植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA 比色法)的計算

產(chǎn)品簡介:

動物或植物細胞發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)時,會發(fā)生脂質(zhì)氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物,一些脂肪酸氧化后逐漸分解

為一系列包括 MDA 在內(nèi)的復(fù)雜化合物,此時通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平,因此 MDA 的測定被廣泛用作脂質(zhì)氧化的指標。生物體內(nèi)的一些其它生化反應(yīng)也會產(chǎn)生MDA,例如 thromboxane synthase 也可以催化產(chǎn)生,但只要在測定時設(shè)置適當(dāng)對照即可觀察到脂質(zhì)氧化水平的變化。植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA 比色法)(Plant MDA Assay Kit with TBA)又稱脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒,是采用一種基于 MDA 和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid, TBA)反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng),隨后通過比色法用于對植物組織(根、莖、葉、種子等)MDA 進行檢測,是專門用于植物脂質(zhì)氧化(lipidperoxidation)水平檢測的試劑盒,不適用于動物組織、細胞、血液等;丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與 TBA 發(fā)生反應(yīng),形成紅色的 MDA-TBA 加合物,MDA-TBA 加合物在 532nm 處有最大吸收,該復(fù)合物的吸光系數(shù)為 155mmol/(L.cm),并且在 600nm 波長處有最小吸收,植物組織中糖類物質(zhì)對MDA-TBA 反應(yīng)有干擾,我們總結(jié)出經(jīng)驗公式,以消除這一干擾,亦可以通過比標準品進行比較,進行含量檢測。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不適用于臨床診斷或其他用途。 

6、離心機

操作步驟(僅供參考)

1、樣本處理:

①制備 MDA 提取液:取適量的植物根、莖、葉子、種子等,稱量后剪碎,按每 0.4g 植物樣品加入 4ml 的比例加入組織勻漿液,充分勻漿(一般取 0.4~1g 植物樣品即可)。4000g離心 10min,取上清液待用,該上清液即為 MDA 提取液;如果采用酶標儀檢測結(jié)果,應(yīng)相應(yīng)減少制備提取液的量,譬如取 0.2g 植物樣品加入 2ml 組織勻漿液。

②樣品準備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,以便于后續(xù)計算單位蛋

白重量植物樣品的 MDA 含量;測定蛋白濃度非必須步驟,亦可采用經(jīng)驗公式計算。

2、配制 TBA 工作液:稱取適量 TBA,用組織勻漿液配制成濃度為 0.68%的 TBA 工作液,例如取 0.068g TBA 用 10ml 組織勻漿液配制,最終濃度即為 0.68%的 TBA 工作液。 TBA 工作液需完全溶解后再使用,可以加熱到 60℃促溶,并可通過反復(fù)劇烈 Vortex 促溶;配制好的 TBA 工作液 4℃避光保存,至少 1 個月內(nèi)有效。

3、稀釋標準品:如果進行簡易快速檢測,標準品直接稀釋至 10μM;如果進行精確檢測,

取適量標準品用組織勻漿液稀釋至 1、2、5、10、20、50μM;如果采用經(jīng)驗公式計算含量,無需標準品;配制好的 MDA 標準品 4℃避光保存,至少 3 個月內(nèi)有效。

4、樣品測定:

①分光光度計測定:在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入 1ml 組織勻漿液作為空白對照,加入

1ml MDA 提取液用于測定,隨后加入 1ml TBA 工作液。

②酶標儀測定:在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入 200μl 組織勻漿液作為空白對照,加入200

μlMDA 提取液用于測定,隨后加入 200μl TBA 工作液。

③混勻, 加蓋,95℃水浴煮沸 30min,加熱時務(wù)必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱

(Heat block)進行加熱注意用重物壓緊離心管蓋;如果使用沸水浴,則需使用可把蓋子鎖

死的離心管或螺旋蓋離心管或用 Parafilm 封住離心管口,用針頭刺一小孔。最方便和準確

的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱的金屬浴或者 0.5ml PCR 儀。

④冷水浴或流水冷卻至室溫,4000g 離心 10min。

⑤取上清,蒸餾水調(diào)零,用分光光度計或酶標儀測定 532nm 處吸光度,如果不方便也可以測定 530~540nm 之間的吸光度,分別記為 空白標準、測定;如果采用經(jīng)驗公式計算,應(yīng)分別測定 450nm、532nm、600nm 處的吸光度,分別記為 A450、A532、A600。

計算:如果進行簡易快速檢測,直接以 10μM 標準品進行計算,獲得 MDA 的摩爾濃度;

如果采用經(jīng)驗公式,無需制作標準曲線或測定標準品;如果需要精確計算,以 MDA 標準品濃度為橫坐標,以對應(yīng)的吸光度為縱坐標,制作標準曲線,根據(jù)標準曲線計算處 MDA 提取液的濃度;對于固體狀組織,可以通過單位重量的蛋白含量或組織重量等來表示最初樣品中 MDA 含量,例如μmol/mg 蛋白或μmol/mg 組織。

簡易快速 MDA 含量計算公式:

MDA 含量(μmol/mg)=(測定-空白)/(標準-空白)×標準品濃度/蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)

式中:測定=待測樣品的 532nm 處吸光度

標準=標準品的 532nm 處吸光度

空白=空白對照的 532nm 處吸光度

標準品濃度=10μM

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)=BCA 法測定的蛋白濃度(mg/ml)

不采用標準品的經(jīng)驗公式:

MDA 濃度(μmol/L)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

MDA 含量(μmol/mg)=MDA 濃度(μmol/L)×MDA 提取液體積(ml)/植物組織鮮重(g)

式中:A532=待測樣品的 532nm 處吸光度

A600=待測樣品的 600nm 處吸光度

A450=待測樣品的 450nm 處吸光度

注意事項:

1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融,以免失效或效率下降。

2、 如果沒有分光光度計,也可以使用酶標儀測定,檢測樣品量會相應(yīng)增加。

3、 待測樣品盡量新鮮,提取后應(yīng)盡快檢測,以免活性下降。

4、 待測 MDA 提取液如不能及時測定,應(yīng)置于-20℃保存,4 天內(nèi)穩(wěn)定。

有效期:12 個月有效。


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