植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA 比色法)的計(jì)算

 植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA 比色法)的計(jì)算

產(chǎn)品簡介：

動(dòng)物或植物細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，一些脂肪酸氧化后逐漸分解

為一系列包括 MDA 在內(nèi)的復(fù)雜化合物，此時(shí)通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平，因此 MDA 的測定被廣泛用作脂質(zhì)氧化的指標(biāo)。生物體內(nèi)的一些其它生化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生MDA，例如 thromboxane synthase 也可以催化產(chǎn)生，但只要在測定時(shí)設(shè)置適當(dāng)對照即可觀察到脂質(zhì)氧化水平的變化。植物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA 比色法)(Plant MDA Assay Kit with TBA)又稱脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒，是采用一種基于 MDA 和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid, TBA)反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，隨后通過比色法用于對植物組織(根、莖、葉、種子等)MDA 進(jìn)行檢測，是專門用于植物脂質(zhì)氧化(lipidperoxidation)水平檢測的試劑盒，不適用于動(dòng)物組織、細(xì)胞、血液等；丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與 TBA 發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的 MDA-TBA 加合物，MDA-TBA 加合物在 532nm 處有最大吸收，該復(fù)合物的吸光系數(shù)為 155mmol/(L.cm)，并且在 600nm 波長處有最小吸收，植物組織中糖類物質(zhì)對MDA-TBA 反應(yīng)有干擾，我們總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)公式，以消除這一干擾，亦可以通過比標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，進(jìn)行含量檢測。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。 

6、離心機(jī)

操作步驟(僅供參考)：

1、樣本處理：

①制備 MDA 提取液：取適量的植物根、莖、葉子、種子等，稱量后剪碎，按每 0.4g 植物樣品加入 4ml 的比例加入組織勻漿液，充分勻漿(一般取 0.4～1g 植物樣品即可)。4000g離心 10min，取上清液待用，該上清液即為 MDA 提取液；如果采用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，應(yīng)相應(yīng)減少制備提取液的量，譬如取 0.2g 植物樣品加入 2ml 組織勻漿液。

②樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋

白重量植物樣品的 MDA 含量；測定蛋白濃度非必須步驟，亦可采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算。

2、配制 TBA 工作液：稱取適量 TBA，用組織勻漿液配制成濃度為 0.68％的 TBA 工作液，例如取 0.068g TBA 用 10ml 組織勻漿液配制，最終濃度即為 0.68%的 TBA 工作液。 TBA 工作液需完全溶解后再使用，可以加熱到 60℃促溶，并可通過反復(fù)劇烈 Vortex 促溶；配制好的 TBA 工作液 4℃避光保存，至少 1 個(gè)月內(nèi)有效。

3、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：如果進(jìn)行簡易快速檢測，標(biāo)準(zhǔn)品直接稀釋至 10μM；如果進(jìn)行精確檢測，

取適量標(biāo)準(zhǔn)品用組織勻漿液稀釋至 1、2、5、10、20、50μM；如果采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算含量，無需標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的 MDA 標(biāo)準(zhǔn)品 4℃避光保存，至少 3 個(gè)月內(nèi)有效。

4、樣品測定:

①分光光度計(jì)測定：在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入 1ml 組織勻漿液作為空白對照，加入

1ml MDA 提取液用于測定，隨后加入 1ml TBA 工作液。

②酶標(biāo)儀測定：在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入 200μl 組織勻漿液作為空白對照，加入200

μlMDA 提取液用于測定，隨后加入 200μl TBA 工作液。

③混勻, 加蓋，95℃水浴煮沸 30min，加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱

塊(Heat block)進(jìn)行加熱注意用重物壓緊離心管蓋；如果使用沸水浴，則需使用可把蓋子鎖

死的離心管或螺旋蓋離心管或用 Parafilm 封住離心管口，用針頭刺一小孔。最方便和準(zhǔn)確

的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱的金屬浴或者 0.5ml PCR 儀。

④冷水浴或流水冷卻至室溫，4000g 離心 10min。

⑤取上清，蒸餾水調(diào)零，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測定 532nm 處吸光度，如果不方便也可以測定 530~540nm 之間的吸光度，分別記為 A 空白、A 標(biāo)準(zhǔn)、A 測定；如果采用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算，應(yīng)分別測定 450nm、532nm、600nm 處的吸光度，分別記為 A450、A532、A600。

計(jì)算：如果進(jìn)行簡易快速檢測，直接以 10μM 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計(jì)算，獲得 MDA 的摩爾濃度；

如果采用經(jīng)驗(yàn)公式，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線或測定標(biāo)準(zhǔn)品；如果需要精確計(jì)算，以 MDA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算處 MDA 提取液的濃度；對于固體狀組織，可以通過單位重量的蛋白含量或組織重量等來表示最初樣品中的 MDA 含量，例如μmol/mg 蛋白或μmol/mg 組織。

簡易快速 MDA 含量計(jì)算公式：

MDA 含量(μmol/mg)=(A 測定-A 空白)/(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)

式中：A 測定=待測樣品的 532nm 處吸光度

A 標(biāo)準(zhǔn)=標(biāo)準(zhǔn)品的 532nm 處吸光度

A 空白=空白對照的 532nm 處吸光度

標(biāo)準(zhǔn)品濃度=10μM

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)=BCA 法測定的蛋白濃度(mg/ml)

不采用標(biāo)準(zhǔn)品的經(jīng)驗(yàn)公式：

MDA 濃度(μmol/L)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

MDA 含量(μmol/mg)=MDA 濃度(μmol/L)×MDA 提取液體積(ml)/植物組織鮮重(g)

式中：A532=待測樣品的 532nm 處吸光度

A600=待測樣品的 600nm 處吸光度

A450=待測樣品的 450nm 處吸光度

注意事項(xiàng)：

1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。

2、 如果沒有分光光度計(jì)，也可以使用酶標(biāo)儀測定，檢測樣品量會(huì)相應(yīng)增加。

3、 待測樣品盡量新鮮，提取后應(yīng)盡快檢測，以免活性下降。

4、 待測 MDA 提取液如不能及時(shí)測定，應(yīng)置于-20℃保存，4 天內(nèi)穩(wěn)定。

有效期：12 個(gè)月有效。

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