Ca++Mg++——ATP酶檢測(cè)試劑盒

標(biāo)題：Ca++Mg++——ATP酶檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品概述

Ca++Mg++——ATP酶檢測(cè)試劑盒

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時(shí)每支加1mL蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃可保存一周。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時(shí)加入3mL雙蒸水， 4℃保存。

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL雙蒸水，溶解后4℃保存一周。

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL雙蒸水，溶解后4℃保存一周。

試劑九： 液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑十：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將貯備液 20倍稀釋?zhuān)?/span>即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

操作步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min

混勻，4000g，常溫離心10min，取上清液

3定磷(在1.5mLEP管中依次加入下列試劑)

混勻，37℃水浴 30 min，冷卻至室溫，在 660nm處比色。

注意：

1、A管為對(duì)照管；B管為Na⁺K⁺-ATP酶測(cè)定管；

2、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒50管保證測(cè) 24份Na⁺K⁺-ATP酶。

3、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。

4、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計(jì)算

1、血清（漿）Na⁺K⁺-  ATPase活力的計(jì)算:

定義：規(guī)定每小時(shí)每毫升血清（漿）中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷V樣÷T=7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

組織中Na⁺K⁺-  ATPase的計(jì)算：

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

定義：規(guī)定每小時(shí)每毫克組織蛋白中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/mg)= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

定義：規(guī)定每小時(shí)每克組織中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g)= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=7.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：規(guī)定每小時(shí)每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/10⁴)= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T=0.015×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.2mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

Ca++Mg++——ATP酶檢測(cè)試劑盒