MMP2/9活性含量檢測(cè)服務(wù)

標(biāo)題：MMP2/9活性含量檢測(cè)服務(wù)

產(chǎn)品概述

MMP2是位于16號(hào)染色體的基因。
MMP-9基因位于染色體20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein,MMP ）家族。主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matris）的動(dòng)態(tài)平衡。

作用功能
該基因是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)基因家族的成員，是一種鋅依賴的酶，能夠切割細(xì)胞外基質(zhì)的成分和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。該基因編碼的蛋白是明膠酶A，IV型膠原酶，其催化位點(diǎn)中含有三個(gè)纖維連接蛋白II型重復(fù)序列，使變性IV型膠原和V型膠原與彈性蛋白結(jié)合。與大多數(shù)MMP家族成員不同，這種蛋白的激活可以發(fā)生在細(xì)胞膜上。這種酶可以被蛋白酶細(xì)胞外激活，也可以被S-谷胱甘肽化而被胞內(nèi)激活，而不需要蛋白質(zhì)溶出的前區(qū)。該蛋白被認(rèn)為參與多種途徑，包括作用于神經(jīng)系統(tǒng)，子宮內(nèi)膜月經(jīng)破裂，調(diào)節(jié)血管化，和轉(zhuǎn)移。該基因突變與Winchester綜合征和結(jié)節(jié)病-關(guān)節(jié)病-骨溶解綜合征(NAO)有關(guān)。選擇性剪接會(huì)導(dǎo)致編碼不同異構(gòu)體的多個(gè)轉(zhuǎn)錄體變異。

檢測(cè)步驟：
1. 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE
凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ?C 加熱5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加
入10 × substrate G 并使之稀釋10 倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
2. 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM
Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅
使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽(yáng)
性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing
buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37?C 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性
對(duì)照或者血中的MMP 通常37?C 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為
10 小時(shí)或過(guò)一夜。
6. 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見SDS-PAGE
凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置
不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及
活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa
位置出現(xiàn)透明條帶。
7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決
辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。
MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。