6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）檢測(cè)試劑盒

標(biāo)題：6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品概述

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)檢測(cè)試劑盒

測(cè)定原理：

G6PDH催化NADP⁺還原生成NADPH，在340 nm下測(cè)定NADPH增加速率。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1，-20℃保存；用時(shí)每支加275μL雙蒸水充分溶解備用； 

試劑三：粉劑×1，-20℃保存；用時(shí)每只加275μL雙蒸水充分溶解備用。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 ：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

G6PDH測(cè)定操作表：

測(cè)定前將試劑一置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱10min左右，將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)；混勻，在34 0 nm波長(zhǎng)下記錄1min時(shí)的初始吸光度A1，迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)5min；迅速取出比色皿并擦干，記錄6min時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：

1、若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。

2、實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑二、試劑三和樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

4、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

G6PDH活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）G6PDH活力的計(jì)算:

單位的定義：每升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 μmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/L）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時(shí)間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA =857×ΔA

2、組織中G6PDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時(shí)間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=857×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/g 鮮重）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時(shí)間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA÷樣品鮮重（g/mL）=857×ΔA÷樣品鮮重（g/mL）

3、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時(shí)間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=857×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/10⁴ cell）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時(shí)間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（10⁴個(gè)/mL）=857×ΔA÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（10⁴個(gè)/mL）

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)檢測(cè)試劑盒