6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）檢測試劑盒

標題：6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）檢測試劑盒

產(chǎn)品概述

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)檢測試劑盒

測定原理：

G6PDH催化NADP⁺還原生成NADPH，在340 nm下測定NADPH增加速率。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1，-20℃保存；用時每支加275μL雙蒸水充分溶解備用； 

試劑三：粉劑×1，-20℃保存；用時每只加275μL雙蒸水充分溶解備用。

樣本的前處理：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備 ：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次）。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

G6PDH測定操作表：

測定前將試劑一置于37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中預熱10min左右，將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，加樣本的同時開始計時；混勻，在34 0 nm波長下記錄1min時的初始吸光度A1，迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）水浴中，準確反應(yīng)5min；迅速取出比色皿并擦干，記錄6min時的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意事項：

1、若A2-A1大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。

2、實驗時，試劑二、試劑三和樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

4、兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準確性。

G6PDH活力單位的計算：

1、血清（漿）G6PDH活力的計算:

單位的定義：每升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 μmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

G6PDH（U/L）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA =857×ΔA

2、組織中G6PDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

G6PDH（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=857×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

G6PDH（U/g 鮮重）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA÷樣品鮮重（g/mL）=857×ΔA÷樣品鮮重（g/mL）

3、細菌或細胞中G6PDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

G6PDH（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=857×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

（2）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

G6PDH（U/10⁴ cell）＝反應(yīng)總體積（800μL）÷樣本體積（30μL）÷反應(yīng)時間(5min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10^-3）×ΔA ÷細菌或細胞密度（10⁴個/mL）=857×ΔA÷細菌或細胞密度（10⁴個/mL）

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)檢測試劑盒